1527年春，查理五世派遣一支軍隊，由波旁公爵率領，從米蘭出發開赴羅馬。5月，雙方軍隊在羅馬城下交戰，波旁公爵戰死。無人指揮的2萬多名德國軍隊和西班牙軍隊紛紛嘩變，他們擁進聖城，不分青紅皂白地燒殺搶劫，無數珍貴的文物聖品被洗劫一空。查理五世在羅馬城下的慘敗增強了弗朗西斯一世奪取勝利的信心。6月，他派大軍進入意大利，陸軍佔領米蘭和帕維亞，艦隊迫使熱那亞倒戈屈服，接著，法將洛特列克率軍南下，遠征那不勒斯。在熱那亞和威尼斯艦隊的支援下，法軍於1528年冬佔領王國大部地區，包圍了那不勒斯城。但就在勝利來臨之際，風雲突變：熱那亞轉向敵人方面，法國失去了制海權；鼠疫在軍中流行，官兵大量死亡。弗朗西斯增兵無源，無法再戰，只好與查理五世議和。根據1529年在康佈雷簽訂的和約，弗朗西斯一世被迫放棄對意大利的主權要求，但法國保留了勃艮第。接著，查理五世又同克裡門七世達成協議：克裡門七世答應把那不勒斯授予查理五世；查理五世則保證派帝國軍隊去推翻新近成立的佛羅倫薩共和國，使美第奇家族得以復辟。